La Resonancia Magnética Nuclear (NMR, del inglés Nuclear Magnetic Resonance) es una rama de la espectroscopía que permite estudiar determinados núcleos atómicos que presentan un momento magnético. Entre éstos cabe destacar por su importancia en Biología y en las Ciencias Médicas al hidrógeno (¹H)₁, comunmente denominado "protón", al isótopo del carbono cuyo número atómico es 13(¹³ C), al fósforo (³¹P) y al flúor (¹⁹ F).

El fenómeno de resonancia magnética nuclear es producido por la irradiación de una muestra en estudio que se encuentra en un campo magnético muy intenso (del orden de los miles de Gauss) con una radio frecuencia que comúnmente cae en el intervalo de las bandas utilizadas por las emisoras de frecuencia modulada. Los núcleos antes mencionados y varios otros núcleos de átomos (excepto aquellos que poseen un número par de masa y carga) generan un momento magnético, pues se encuentran sobre sí mismos y poseen una carga neta. Se puede que los núcleos de estos átomos se comportan como pequeñas barras magnéticas

Cuando estos núcleos, por ejemplo los del hidrógeno del agua, se someten a un campo magnético (H₀) intenso, tienden a (H₀) alinearse en forma paralela, ya sea en el mismo sentido del campo o en contra de él. A temperatura ambiente y en un campo magnético de unos 10.000 Gauss se encontrará una proposición de aproximadamente 1 núcleo en 100 mil alineado en favor del campo. Si tomamos como ejemplo el caso del agua, cuya concentración es 55,5 molar, tendríamos en la solución - y dependiendo del volumen de la muestra- suficientes núcleos alineados a favor del campo como para producir un pequeño vector resultante en la solución. Hagamos un pequeño cálculo a manera de ejercicio. Supongamos que el volumen de la muestra es de 1 mililitro.

Si la concentración del agua es, como dijéramos, de 55,5 molar tendríamos 0,055 moles en un mililitro. Si un mol contiene 6,023 x 10²³ moléculas de agua y si cada molécula de agua (H₂0) contiene 2 átomos de hidrógeno, tendremos un total de 6,29 x 10²² núcleos de hidrógeno ( esto significa aproximadamente un número 7 seguido de 22 ceros). Como los núcleos se encuentran girando (procesando) con un cierto ángulo alrededor de las líneas del campo H₀ a una determinada frecuencia (frecuencia de Larmor), se producirá la absorción de energía por parte del núcleo cuando éste entra en resonancia al aplicar una frecuencia igual a la de Larmor sobre una bobina orientada de modo que produzca un campo magnético H₁ perpendicular al campo H₀. Este fenómeno genera en un espectro de NMR una línea de absorción con una intensidad de señal y localización característica que depende del entorno químico, es decir de la presencia de otros átomos que rodean al núcleo bajo estudio.

El interés de este artículo es mostrar de manera un poco mas profunda algunas metodologías recientes de NMR que están siendo aplicadas tanto al estudio de macromoléculas de interés biológico como al reconocimiento de algunos metabolitos claves para el diagnóstico de algunas patologías.

Los parámetros tanto estructurales como dinámicos más utilizados en NMR para identificar y conocer las propiedades del entorno de un determinado núcleo son: la intensidad de la señal, el desplazamiento químico de ésta, su desdoblamiento y constante de acoplamiento (J), y las velocidades de relajación longitudinal y transversal.

La intensidad de la señal es proporcional al número de núcleos que se encuentran resonando. El desplazamiento químico nos da cuenta del entorno electrónico inmediato que rodea al núcleo en una molécula. El desdoblamiento de la señal y su constante de acoplamiento nos dicen cuántos y que tipo de núcleos se encuentran cercanos al núcleo bajo estudio. Finalmente, las velocldades de relajación nos indican la distancia que se encuentran los núcleos vecinos o algún centro magnético producido, por ej. por un metal paramagnético como manganeso o gadotinio. A partir de estos parámetros podemos entonces identificar una determinada molécula de importancia metabólica (metabolito) o bien conocer la localización de un aminoácido en una proteína o un azúcar en la molécula de almidón.


Macromoléculas biológicas

Utilizando resonancia magnética bidimensional (2D-NMR) en la que se combinan a la vez un par de los parámetros que hemos mencionado, hoy en día es posible determinar la estructura tridimensional de pequeñas moléculas de proteína que tienen volumen de unos cientos de Angstroms cúbicos y - dentro de ellas - conocer la estructura tridimensional del sitio de unión de moléculas aun más pequeñas, de unos pocos Angstroms cúbicos. Con el conocimiento de la estructura tridimensional de estas moléculas se ha podido determinar su localización - por ejemplo- en la estructura de un virus y, con la ayuda de la cristalografía de rayos X, diseñar drogas que ataquen al virus en lugares específicos, inhibiendo su acción. Esto constituye un avance revolucionario pues permitirá dentro de pocos años disponer de una ingeniería de macromoléculas que permitirá diseñar fármacos contra cualquier tipo de virus patógeno el cual se le haya determinado la estructura de las proteínas que lo constituyen.


Metabolitos

La identificación y cuantificación de un determinado metabolito en solución presente en tejidos y órganos de manera no invasiva a través de NMR, ha permitido investigar la energética bioquímica de la contracción muscular y con ello aumentar el conocimiento sobre algunas enfermedades musculares. No sólo el tejido muscular ha sido objetivo de innumerables estudios, también la bioquímica del cerebro humano, del hígado y de los riñones está siendo objeto de una intensa investigación. En el estudio de la energética celular se encuentran involucradas la fuente y la utilización de la energía química. En el músculo esquelético, músculo cardíaco y cerebro estas reacciones están centradas alrededor del uso del trifosfato de adenosina (ATP, del inglés adenosine triphosphate) como fuente de energía como la representa el esquema 1.

En este esquema se muestran algunas reacciones en las que, los alimentos que constituyen nuestra ingesta van siendo degradados hasta su oxidación en la mitocondria en presencia de oxígeno molecular. En este proceso mitocondrial denominado respiración se produce la fosforilación de ADP (del inglés adenosine diphosphate) para formar el ATP. También ATP puede ser sintetizado a partir de fosfocreatina y ADP. La fosfocreatina sirve de reservorio do fosfato para la fostorilación del ADP.

El nivel celular de ATP se encuentra estrictamente controlado y normalmente depende de la velocidad a la que se sintetiza en forma aeróbica (fostorilación oxidativa en la mitocondria) y de la demanda de ATP (hidrólisis del ATP) producto del trabajo celular. Para tener una idea aproximada de la envergadura de estos procesos de síntesis y utilización de ATP, digamos que un individuo adulto, que desarrolle una vida normal, consume al día 40 Dg. de ATP, y en ningún momento la concentración celular de este metabolito varía en forma sustancial. De este modo, esa enorme cantidad de ATP requerida, es suplida sin mayor problema por la célula a la misma velocidad que se consume. Los sustratos para la fosforilación oxidativa son aportados por la sangre circulante (por ejemplo, azúcares, grasas y aminoácidos) o son endógenos en la célula (por ejemplo, glicógeno).

De ese modo, las preguntas acerca de la regulación de la actividad de la mitocondria y la selección de los sustratos con que opera llegan a ser importantes. Desde la década de los cuarenta cuando Fritz Lipman publicó los trabajos clásicos sobre la importancia bioquímica en los procesos metabólicos de los compuestos fosforilados, se ha investigado activamente sobre la participación de estos intermediarios metabólicos tanto en el catabolismo ( que genera ATP) como en el anabolismo (que lo consume). Sólo en 1974 se descubrió que los metabolitos que contenían fósforo podían ser detectados en músculos intactos por medio de NMR de ³¹fósforo. A partir de este trabajo la aplicación de la espectroscopia de NMR a la bioquímica del metabolismo humano in situ ha evolucionado espectacularmente.

Mencionaremos como ejemplo un artículo de Briton Chance recientemente aparecido en la literatura. Utilizando un equipo provisto de un imán apropiado, se pudo seguir la variación de los metabolitos fosforilados en el tiempo mientras el paciente realizaba ejercicio físico. El ejercicio se cuantificó mediante un aparato para medir trabajo. Lo que se observó fue que en los primeros minutos de ejercicio se producía un brusco descenso en la concentración de fosfato inorgánico mientras que los niveles de ATP y ADP se mantenían constantes. Al finalizar el ejercicio se recuperaban los niveles de fosfocreatina y el fosfato inorgánico disminuía a niveles normales. (ver Fig 1). Estos estudios confirmaron que, pese a que el ATP es - por antonomasia- la molécula capaz de transferir energía, y que el músculo en ejercicio consume grandes cantidades de ella, su concentración se mantiene casi constante. La fuente de energía más inmediata en este caso es la fosfocreatina, pero dado que ésta se encuentra en bajas concentraciones tiende a agotarse con facilidad.

Este problema lo resuelve el músculo normalizando los niveles de fosfocreatina a expensas de la producción de ATP a partir de los sustratos metabolizados en la mitocondría (ver esquema 1). Este mecanismo le permite al organismo tener siempre una fuente de energía disponible sin que el ejercicio se vea afectado por posibles oscilaciones en el aporte de sustratos. Podemos imaginar que esta situación es similar a lo que ocurriría con una represa llena de agua que alimenta un sistema motriz que funcione con un pequeño flujo de agua. Una buena manera de asegurar el óptimo funcionamiento del sistema es entregándole agua en forma absolutamente constante e independiente de las oscilaciones del agua que surte a la represa.

Utilizando la espectroscopia de NMR en humanos se ha venido ganando experiencia de modo de definir las condiciones clínicas donde los estudios metabólicos pueden ser útiles. Utilizando esta aproximación se han estudiado diversas anormalidades. Ejemplo de estos son tumores cerebrales, perfusión reducida del cerebro, sobre carga de hierro en el hígado, enfermedades de almacenamiento de glicógeno, intolerancia a la fructosa y hepatitis etc. Algunas alteraciones funcionales de los recién nacidos tales como cardiomiopatías, tumores hepáticos y asfixia al nacer, también han podido ser estudiados utilizando esta técnica. Sin embargo, dado que diagnostico y comprensión de una enfermedad no constituyen sinónimos, se presenta como una tarea muy relevante el continuar estos estudios con el fin de dilucidar las preguntas bioquímicas fundamentales que llevan a la comprensión íntima de las patologías humanas. La resonancia magnética nuclear tiene mucho que ofrecer como una nueva fuente de información bioquímica y como una espectroscopia que reúne la práctica clínica y el conocimiento bioquímico.


Apoyo de IBM

La firma IBM hizo posible la traída de un espectrofotómetro de NMR de 90 MHz con transformada de Fourier, el cual se encuentra en funcionamiento. La puesta en marcha de este espectrómetro fue el motivo de las Tesis de dos ingenieros electrónicos de la Universidad de Chile. Ello nos ha permitido contar en la actualidad con un equipo de gente altamente especializada no solo en el manejo del instrumento sino también en el diseño de nuevas partes de software como hardware. Posteriormente se recibió un segundo espectrómetro mas poderoso con un imán superconductor de 300 MHz el que implementó un centro dedicado a la resonancia nuclear.



Dr. Octavio Monasterio O.

Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular.
Facultad de Ciencias, Universidad de Chile.