Durante más de un siglo, y como consecuencia de su rol fundamental en la vida de la mayoría de los organismos superiores, el proceso de la fertilización ha sido de un especial interés para los científicos. A partir de las contribuciones de científicos como Van Veneden, Hertwig y FoI, realizadas entre 1875 y 1880, mucho se ha logrado avanzar en la comprensión de los mecanismos implicados en la fertilización de animales mamíferos.

En los últimos años este conocimiento nuevo ha ejercido una tremenda influencia, tanto en aspectos de carácter ético, como el tema de la concepción y la contraconcepción, como asimismo en el campo de la medicina asociada al estudio de problemas de fertilidad. Bajo este prisma, en el campo de la Biología Reproductiva, una de las preguntas más recurrentes y cruciales es la siguiente: ¿Cuáles son los atributos fundamentales de una muestra de semen para ser considerada fértil? La respuesta es simple y corta: por definición, será aquella que pueda fertilizar un óvulo y promover el normal desarrollo de un embrión.

Esta respuesta encuentra su demostración más concreta en especies de animales de población masiva. Es así como la capacidad fertilizante de una muestra se puede determinar en forma retrospectiva, diluyendo el semen, inseminando varias hembras y posteriormente analizando las proporciones de concepción. Este tipo de prueba es común en los planteles de crianza de animales, y se utiliza en forma rutinaria para evaluar la capacidad fértil del ganado reproductor (sementales). Sin embargo, la predicción de la capacidad fértil de un espermatozoide sin recurrir a experimentos de inseminación es una cosa muy diferente, donde la complejidad y la incertidumbre se dan la mano.


La apariencia no es garantía

El ratón saltador de Australia produce pocos espermatozoides y a menudo extrañamente malformados. Contrariamente, los espermatozoides de cualquier otro roedor semejante son eyaculados en gran cantidad y con buena apariencia. Con estos antecedentes se podría aventurar que los espermatozoides del ratón saltador fuesen subfértiles, o peor, infértiles. Sin embargo, el macho requiere de un solo apareamiento para producir preñez en la hembra. Así, estos espermatozoides, que desde el punto de vista morfológico parecieran anormales, son, sin embargo, sanos y funcionales desde el punto de vista fisiológico, puesto que pueden fertilizar un oocito. De nuevo surge la pregunta clave:

¿Qué propiedades esenciales debe tener un espermatozoide de mamífero que le permitan fertilizar un óvulo?

Varios institutos de investigación en biología de gametos han tratado de responder esta pregunta con el fin de evaluar la fertilidad potencial del semen de mamíferos. Además de la importancia obvia que estas investigaciones tienen en medicina humana, en la actualidad se les atribuye un gran valor en el estudio de la fertilidad de mamíferos exóticos criados en cautiverio, la mayoría de los cuales se encuentra en vías de extinción.

La mejor comprensión que hay tenemos de la compleja fisiología del espermatozoide ha permitido el desarrollo de nuevos tests que dan una buena indicación acerca de la capacidad fertilizante de una determinada población de espermatozoides. Algunos de estos tests también han ayudado al diagnóstico y tratamiento de la infertilidad en el hombre, como también al desarrollo de la próxima generación de anticonceptivos.


Historia anatómica y funcional del espermatozoide

La capacidad fértil de un espermatozoide está dada por un complejo proceso de desarrollo cuyas etapas hoy se conocen con exactitud. Al interior del testículo --específicamente en los denominados túbulos seminíferos–, los espermatozoides se originan a partir de una célula germinal indiferenciada, la espermatogonia. Luego de un proceso que puede durar hasta 70 días, las células se dividen, desarrollan, diferencian y especializan bajo la influencia de hormonas esteroidales y proteicas. La producción diaria de espermatozoides puede ser altísima, alcanzando en algunas especies valores de tres mil millones de espermatozoides por testículo por día; lo que es sorprendente, sin embargo, es que los espermatozoides que salen del testículo de todas las especies hasta ahora examinadas son incapaces de fertilizar al huevo, necesitando un periodo adicional de maduración en un conducto denominado epidídimo para adquirir toda su capacidad fértil. El proceso de maduración puede llegar a ser extremadamente complejo, como en el caso de los marsupiales, donde ocurren reorganizaciones de los componentes del espermatozoide, como también interacciones célula-célula que, se cree, son fundamentales para el posterior proceso de interacción gamética y una fertilización exitosa.

Una gran proporción del conocimiento en este campo disponible en la actualidad proviene de estudios que han utilizado el modelo del hámster dorado, animal que presenta una serie de ventajas respecto de otros animales de laboratorio. Desde un punto de vista práctico, tanto los testículos como el epidídimo son relativamente grandes, por lo que resulta razonablemente fácil la obtención de muestras de espermatozoides de diferentes regiones de dicho tracto. Además, el manejo de los gametos del hámster dorado, como también las técnicas de fertilización in vitro, se encuentran hoy bastante bien definidas. En este sentido es necesario dejar en claro que el hámster fue el primer mamífero en el cual se realizo una fertilización in vitro completa hace ya alrededor de 25 años.

Recientemente se ha demostrado que secreciones de las células epiteliales del ducto epididimario son responsables de la maduración final del espermatozoide, lo cual ha abierto la excitante perspectiva de poder madurar espermatozoides in vitro. El uso de anticuerpos monoclonales que se unen a la superficie de estas células ha permitido revelar que los espermatozoides adquieren su capacidad fertilizante cuando cierto tipo de glicoproteínas se une a su superficie En la actualidad se trata de dilucidar la exacta naturaleza de dichas proteínas con el fin de obtener un marcador eficaz de maduración espermática. Por otro lado si se pudiese interferir con la función de dicha(s) proteína(s), sería posible en el futuro diseñar un nuevo mecanismo de contraconcepción masculina.

Una vez maduro y eyaculado el espermatozoide debe ser capaz de superar diferentes situaciones relacionadas consigo mismo y con su entorno para alcanzar una fertilización exitosa. En primer lugar para llegar hasta el oocito debe superar algunos obstáculos propios del tracto genital femenino, tales como el cervix y la unión del útero con la Trompa de Falopio. Luego experimenta el fenómeno de reacción del acrosoma mediante el cual el espermio fusiona las membranas asociadas a este organelo (especie de capuchón que cubre los dos tercios anteriores de la cabeza del espermatozoide) formando vesículas que posteriormente se disgregan vertiendo su contenido rico en enzimas hidrolíticas de diversos tipos. Este importante fenómeno es fundamental para la penetración del espermatozoide a través de la envoltura glicoproteica del oocito o zona pelúdica Una vez ocurrida esta, y como una etapa final, la membrana plasmática del espermatozoide

- localizada en la mitad de la Cabeza del espermatozoide (el segmento ecuatorial)- se fusiona con la membrana del oocito de manera que el material genético contenido en el núcleo del espermatozoide se incorpore al citoplasma del huevo. En la medida en que cada uno de estos procesos se pueda controlar in vitro, es posible evaluar con bastante precisión la capacidad de un espermatozoide para fertilizar un oocito.


Movimiento: calidad vs. cantidad

En el ámbito de la biología reproductiva siempre se ha asociado el movimiento de los espermatozoides con su fertilidad y por lo tanto el semen que no contiene espermatozoides motiles es siempre, infértil (a menos que la fecundación sea asistida por técnicas de microinyeción). Sin embargo, el coroIario de que los espermatozoides motiles sean fértiIes no es siempre necesariamente verdadero. Hace solo algunos años se ha logrado correlacionar ciertas características del movimiento del espermatozoide con la capacidad fertilizante, lográndose demostrar que en la mayoría de los casos no es la concentración o proporción de espermatozoides motiles en una muestra de semen lo que determina la fertilidad, sino mas bien la velocidad y la forma en que éstos se mueven: es decir, calidad más que cantidad.

Es sabido que diferentes especies producen espermatozoides con características propias de motilidad. Sin embargo, con un correcto marco de referencia los investigadores pueden evaluar la fertilidad de un animal individualmente. Al colocar una gala de semen bajo el microscopio a una temperatura constante (3ºC a 37ºC) se pueden evaluar las características de movimiento de un espermatozoide. Con este propósito primeramente se utilizó un laborioso procedimiento que consistía en eI análisis visual individual de las imágenes obtenidas aI filmar un espermatozoide durante un segundo. Actualmente el procedimiento total se ha hecho más rápido y fácil dados los recientes avances en el análisis de imágenes asistidos por métodos computacionales. Este tipo de instrumentos puede registrar la huella de un espermatozoide en movimiento sobre un porta-objeto (al microscopio de luz) y dar un análisis completo de las características de motilidad de tal espermatozoide, dentro de unos pocos minutos. Esta técnica se ha utilizado con frecuencia en la evaluación de la fertilidad de espermatozoides previamente congelados en nitrógeno Iicuado. Es así coma investigadores del Instituto de Zoología del Jardín Zoológico de Londres lograron evaluar sus métodos de criopreservación de espermios a través de este sistema, utilizando células de un panda gigante. Posteriormente estos estudios fueron corroborados plenamente al obtenerse una exitosa inseminación de una panda hembra del Zoológico de Madrid con semen del macho del Zoo londinense.

De esta misma forma se ha evaluado la fertilidad del semen humano, Hace unos pocos años, en nivel de experimentos de laboratorio, se logró demostrar que muestras de semen que poseen espermatozoides que se mueven mayoritariamente a una velocidad promedio de 20 o más micrómetros por segundo tienen una probabilidad de 80 por ciento superior de fertilizar huevos que aquellas con espermatozoides de menor velocidad promedio, sin considerar otras características del espermatozoide. Este resultado indica que, al menos en el tubo de ensayo, la capacidad de un espermatozoide para moverse correctamente es en extremo importante para la fertilización.

Más recientemente se ha probado esta hipótesis utilizando semen de donantes para inseminación artificial. En este tipo de experiencias, los donantes de semen son controlados a intervalos regulares de tiempo, con el objeto de asegurar la ausencia del virus causante de SIDA. Luego de este control, el semen es congelado y almacenado durante tres meses en nitrógeno líquido. Aunque generalmente el espermatozoide humano se puede congelar y descongelar sin efectos nocivos, a veces algunas muestras de semen pierden su capacidad fertilizante durante este proceso. En experimentos muy bien controlados, se ha podido discriminar entre muestras de semen con alto o baja índice de concepción mediante la sola observación, la velocidad de movimiento de los espermatozoides y su capacidad de sobrevivencia a incubaciones in vitro a 37ºC. Sin embargo, hasta este instante los investigadores no han podido entender con claridad la relación entre velocidad de movimiento del espermatozoide y fertilidad. Muy posiblemente, la velocidad a la cual ellos nadan es el reflejo de un optimo estado integral de la célula. También se podría considerar que los espermatozoides necesitan una mínima fuerza propulsora para penetrar el moco cervical y así pasar del útero a la Trompa de Falopio. En muchas especies el espermio sacude vigorosamente su cola justo antes de la fecundación. Este tipo de movimiento, conocido como hiperactivación de la motilidad podría ser la propulsión final necesaria para la penetración a través de las envolturas del huevo. En todo caso, existe consenso acerca de que cualquiera sea la razón, la medida de la velocidad de movimiento del espermatozoide proporciona una mucho mejor idea acerca de su capacidad fertilizante que cualquier otro test convencional, como el recuento espermático la clasificación de su morfología o la evaluación subjetiva de su motilidad a la observación microscópica. En general, todas estas pruebas son de muy poco valor en la evaluación de infertilidad, pero desafortunadamente a menudo son los únicos de los que se dispone en las clínicas de infertilidad.


La importancia del acrosoma

Además de la mantención de una motilidad correcta, el espermatozoide debe también experimentar algunos cambios estructurales al penetrar el oocito. Un evento crucial, al cual ya nos hemos referido, es la reacción acrosómica, la cual es estimulada in vivo por algunos componentes del fluido oviductual, o bien, por el contacto con los componentes de la zona pelúcida. Dichos factores promueven - a nivel de la cabeza del espermatozoide- una serie de reacciones bioquímicas que se traducen en la fusión de la membrana acrosomal externa y la membrana plasmática que la recubre, este proceso genera poros a través de los cuales se dispersa el contenido acrosomal. Finalmente, el capuchón acrosomal se desprende totalmente. Esta reacción debe ocurrir antes de que el espermatozoide alcance la membrana plasmática del huevo. Los espermatozoides que fracasan en experimentar la reacción acrosómica, los que tienen alguna anomalía a nivel del acrosorna o más simplemente los que carecen de él, son infértiles con absoluta certeza. De esta manera. el desarrollo de algún test de diagnóstico para acrosomas funcionales podría proveernos de una valiosísima información acerca de la capacidad fertilizante de una determinada población de espermatozoides.

En la actualidad, a nivel de laboratorio, es posible identificar un espermatozoide que ha experimentado la reacción acrosómica mediante la utilización de anticuerpos (a los cuales se les une algún marcador fluorescente), que son capaces de reconocer solamente la estructura acrosomal. A este respecto, es quizás importante conocer el caso ocurrido en el Instituto de Zoología del Jardín Zoológico de Londres, donde sus investigadores han logrado desarrollar un anticuerpo de tipo monoclonal capaz de reconocer un componente acrosomal que parece común a todos los mamíferos placentarios. Indudablemente, esto resulta ideal para instituciones de este tipo, donde con cierta frecuencia se deben realizar exámenes de semenes provenientes de diferentes especies animales. Además esta técnica ha demostrado ser igualmente importante y eficaz para la evaluación tanto del espermatozoide humano como de especies animales domésticas.

Una de las etapas finales del proceso de fertilización es la fusión del espermatozoide con la membrana plasmática del oocito que permite que su material genético pueda entrar al citoplasma del huevo. La región del espermatozoide implicada en este proceso es el denominado segmento ecuatorial. Esta región persiste luego de la reacción acrosómica y se funde muy fácilmente con el huevo; luego, una vez que el espermio penetra la zona pelúcida, la fusión se produce muy rápidamente, completando la fertilización. En la mayoría de los animales el huevo y el espermio se fusionan sólo si son de la misma especie, y la especificidad pareciera residir en la zona pelúcida del huevo. Al respecto, en 1976 Yanagimachi y sus colaboradores de la Universidad de Hawai descubrieron que los huevos de hamster desnudados de su zona pelúcida por tratamiento con tripsina (una enzima que digiere proteínas) eran receptivos al espermatozoide humano. Este hallazgo sirvió de base para el procedimiento conocido como test de penetración del huevo de hamster (TPHH), que utiliza huevos sustitutos. En este test se incuban espermatozoides con huevos de hamster sin zona pelúcida, y luego se evalúa la fusión de ambas células al microscopio. Dado que los huevos de hamster son fáciles de obtener y de manipular, muchos investigadores utilizan este test hoy en día para el estudio de la función espermática en variadas especies animales. Sorprendentemente, se ha encontrado que espermatozoides de marsupiales e incluso de algunas aves son capaces de fusionarse con el huevo de hamster, haciéndonos pensar que posiblemente mecanismos bioquímicos y fisiológicos comunes están involucrados en este fenómeno.

Irónicamente, la naturaleza poco selectiva del huevo de hamster ha llevado a muchos investigadores a cuestionar la validez del TPHH, particularmente en la evaluación de la capacidad fertilizante del espermatozoide humano. Recientemente se ha desarrollado una versión mucho más sofisticada de este test, que utiliza huevos humanos cuya fertilización ha fracasado en los procedimientos rutinarios de fertilización in vitro. Normalmente, estos huevos son desechados, pero si se los conserva en soluciones de alta concentración salina es posible preservar la actividad biológica de la zona pelúcida, lo que les permite ser utilizados en un test combinado. Dicho test, que consiste en la utilización del huevo de hamster libre de zona, además de la zona pelúcida humana, sirve para evaluar por una parte la capacidad del espermatozoide humano para unirse y penetrar a zona, como también la capacidad para fusionar sus membranas con las del huevo; de esta manera se tiene un ensayo más completo y riguroso desde el punto de vista de la probabilidad de un diagnostico correcto.

Estos procedimientos también se han podido utilizar con objetivos básicos: por ejemplo, en la clasificación de anticuerpos de tipo monoclonal usados en la disección del proceso reproductivo. A este respecto resulta particularmente interesante el hallazgo de un anticuerpo que es capaz de bloquear la adhesión del espermatozoide humano al huevo, puesto que se une a un componente del segmento ecuatorial del espermatozoide. La identificación del gen que codifica para este componente de la superficie del espermatozoide podría llevar más adelante al desarrollo de una nueva vacuna anticonceptiva. En este momento se está tratando de encontrar este y otros genes similares utilizando material genético proveniente de células germinales (las que dan origen al espermatozoide) de testículo humano.

Estos nuevos tests para la evaluación de la función espermática se utilizan por ahora preferentemente en laboratorios de investigación, pero ya las clínicas que estudian y tratan infertilidad masculina están adoptándolos lentamente. Resultados de diversos investigadores en este campo indican que en la mayoría de los casos estos métodos permiten predecir la capacidad fertilizante del espermatozoide en un amplio rango de animales mamíferos. Una de las más importantes aplicaciones de estos métodos ha sido el establecimiento y la evaluación de stocks de sémenes congelados de algunas especies animales amenazadas de extinción.




Miguel N. Llanos S.


Unidad Biología de la Reproducción INTA.
Universidad de Chile


Referencias


- Testart, J (1982). La fecundación externa del óvulo humano. Mundo científico, 2; 352-365.

- Wassarman, P.M. (1987). The Biology and chemistry of Fertilization. Science, (1987). 235. 553-560.

- Wassarman, P.M. Fertilization in mammals. Scientific American, 259: (1988). 52-58.

- Yanagimachi, R. (1984). Zona - free hamster eggs. Their use in assessing fertilizing capacity and examining chromosomes of human spermatozoa. Gamete Res. 10:187-232.