El Plan Nacional de Reforestación, plantea indirectamente algunas interrogantes en torno al destino del millón 200 mil hectáreas plantadas de pinos y que en los próximos 25 años alcanzarán su plena madurez. Cuando ello suceda Chile dispondrá de la mayor reserva mundial de esa especie arbórea. Por eso que vale la pena preguntar si el país va a seguir exportando este recurso como troncos o astillas; si se le usará en el país en la construcción o se exportará como celulosa o papel. Si se decide esto último, se estima que será necesario invertir unos dos mil millones de dólares para poner en marcha unas ocho nuevas plantas para tal fin.


Nuevas alternativas

Es importante entonces revisar lo que está sucediendo en el campo de la investigación científica en torno a estas especies de uso industrial. Los procesos de transformación microbiológicos que cobran cada vez más interés ofrecen dos nuevas alternativas; usar la celulosa luego de su hidrólisis en sus componentes básicos, los azúcares, los que una vez fermentados podrían ser convertidos en etanol u otros productos que el país compra hoy afuera, y presentar a la industria de la celulosa y el papel la factibilidad de tratar por estos procesos biotecnológicos parte de la lignina -estructura que envuelve a la celulosa- mejorando así los costos de producción y la calidad del producto final.

El recurso celulósico no sólo se encuentra en los pinos sino que en una gran cantidad de desechos agrícolas que actualmente son subutilizados, como pajas del trigo y cañas de maíz, entre otros. Estos últimos, junto a los residuos forestales como el aserrín de pino y aquellos resultantes de la mantención de los bosques (clareo y raleo) podrán ser aprovechados ventajosamente, gracias a estos nuevos procesos no convencionales.

Las razones son evidentes. Por un lado existe una mayor especificidad y rendimiento de los productos deseados. Por otro, se requiere de un gasto energético mucho menor ya que la temperatura de crecimiento del organismo es baja (25 - 50° C ), comparativamente a la utilizada en los clásicos procesos químicos (150 - 500° C.). Asimismo, se cuenta con la alta potencialidad de mejorar la eficiencia de las reacciones enzimáticas implicadas a través del gran aporte que está entregando la ingeniería genética.


Una molécula especial

El interés de los investigadores se centra en buscar cómo y cuáles seres vivos realizan eficientemente la degradación de estos recursos en la naturaleza. En particular, el objetivo es acceder al más importante recurso de la pared de la célula vegetal, la celulosa. La primera etapa, y sin duda la más importante, es penetrar una gran barrera constituida por dos estructuras, la lignina y la hemicelulosa, las cuales forman una matriz amorfa que "encadena", progresivamente, a las fibras de celulosa desde la diferenciación celular. Esto impide, justamente, poder llegar con facilidad hasta este principal recurso.

La celulosa es un polímero, es decir está formada sobre la base de unidades repetitivas de glucosa enlazadas por un tipo de unión covalente (fuerte). La hemicelulosa también es un polímero, pero relativamente ramificado y compuesto por varios azúcares. La estructura de la lignina -en cambio- es mucho más compleja (está formada por una unidad de base que comprende un anillo aromático -molécula cíclica- y una cadena lateral de tres carbones). En función de la sustitución sobre el anillo resultan tres unidades monoménricas distintas. En contraste a los polisacáridos, la lignina presenta una amplia gama de enlaces, lo que la hace un polímero muy heterogéneo. Estos pueden darse entre ambos anillos o entre el anillo y uno de los carbonos de la cadena o entre una cadena y otra.

La lignina se caracteriza por poseer una estructura amorfa, un peso molecular indefinido, además de ser insoluble en cualquier solvente orgánico; le entrega rigidez y flexibilidad a los vegetales, se encuentra en los tejidos que llevan la savia. También es difícilmente atacable, por el hecho de que sus enlaces necesitan una alta energía de activación para la depolimenrización en sus unidades. Esta última característica, junto a la notable diversidad de la lignina, son las dos razones que hacen que muy pocos microorganismos sean capaces de atravesarla.


Comunidad eficiente

Hasta hoy día se conoce una sola clase de seres vivos capaces de degradar eficientemente lignina. Se trata de los hongos Basidiomicetes, denominados "pudrición blanca", ya que producen un blanqueamiento de la madera al degradar la lignina. Entre éstos se encuentra uno particularmente estudiado, Phanerachete chrysosporium, que exhibe características muy interesantes. Crece muy rápido, produce gran cantidad de esporas y se desarrolla a elevadas temperaturas, del orden de los 40° C.

Hasta aquí no se ha hecho referencia acerca de la substancia química capaz de transformar la lignina. Hacia fines de año 1983 no había sido posible hallar ninguna enzima que pudiera realizar ese proceso. Mientras tanto, se creía posible que no participara un factor enzimático, dada la gran heterogeneidad de la lignina. Se pensó que, como a una enzima se la conoce por su especificidad, tal vez podrían ser más idóneos en el proceso los radicales derivados del oxígeno, los cuales poseen electrones desapareados y, por lo tanto, son altamente reactivos. Se demostró que uno de ellos, el radical superóxido, en alguna medida, estaba involucrado en la degradación.

Antes de finalizar 1983, Kirk y colaboradores, del Forest Products Laboratory, Forest Service, Madison, EE.UU., descubrieron la primera enzima extracelular degradadora de la lignina. La llamaron ligninasa. Este hallazgo causó gran impacto, porque como detrás de cada enzima hay un gen que la codifica, era dable optimizar el fenómeno responsable de la reacción a través de la ingeniería genética.

No obstante, los mecanismos de acción biológica también pueden convertirse en más eficientes una vez conocidas las condiciones fisiológicas más favorables para su expresión. En este sentido se demostró que las mismas condiciones se cumplían tanto en la actividad de la enzima aislada como en el sistema de cultivo completo, es decir, la lignina, el hongo y la ligninasa. Por ejemplo, se probaron tres condiciones fundamentales y una de ellas fue que a una mayor presión parcial de oxígeno el rendimiento de degradación del hongo aumentaba de manera concomitante. De igual forma se observó que igual cosa sucedía con la ligninasa sola.

Por otro lado se determinó que la degradación de la lignina se desencadena, exclusivamente, cuando el hongo en su medio de cultivo carece de uno de los nutrientes esenciales para su crecimiento. Durante esta fase, denominada estacionaria, los organismos sintetizan la ligninasa, quizás con el fin de llegar a la celulosa o a algún nutriente, al cual la lignina les cierra el acceso.

Esto indicaba la existencia de "factores represores" de la actividad lignolítica cuando todos los nutrientes estaban en exceso. Así sucedió resultando ser el nitrógeno y el carbono las principales fuentes represoras y, en tal sentido, para iniciar las síntesis uno de esos elementos debe reducirse a un estadio basal o mínimo.

En cuanto a la tercera condición, se demostró que la degradación de la lignina no era inductible. En otras palabras, si se hace crecer al hongo en ausencia de lignina, siempre habrá síntesis de ligninasa durante el período estacionario. Sobre este particular aún hay discrepancias dado que la actividad enzimática sería inductible y constitutiva a la vez. O sea, si se adiciona lignina al medio de cultivo, la síntesis es mucho mayor.

Finalmente se demostró que estos hongos lignolíticos no son capaces de crecer sobre la lignina cuando ésta es la única fuente de carbono presente en el medio de cultivo. En efecto, los hongos necesitan, inicialmente, un co-substrato fácilmente degradable, como la glucosa o la celulosa. Sólo entonces estarían en condiciones de degradar a la lignina.

Investigadores franceses del Laboratorio de Microbiología del Instituto Nacional Agronómico de París, demostraron recientemente que esta clase de hongos también pueden emplear como fuente de carbono, para la producción de ligninasa, aquellos provenientes de los ácidos grasos. Se observó asimismo que en medios de cultivo con agitación no se producía la síntesis de lignina. Sin embargo Kirk y sus colaboradores demostraron que esto podía implementarse añadiendo detergentes como el Tween 80. Esto es importante si se considera que la agitación permite un medio homogenizado y aumenta la cantidad de oxígeno disuelto permitiendo así escalar rápidamente la producción de enzimas.


Otras herramientas

La ligninasa -como enzima extracelular- está facultada para transformar su sustrato hasta productos de más bajo peso molecular. Estos, posteriormente, son retornados por otras enzimas intracelulares del hongo que lo degradan y metabolizan hasta la última etapa (anhídrido carbónico).

La originalidad de los hongos lignolíticos reside, precisamente, en el hecho de que son capaces de llevar a cabo esta primera etapa de degradación de la lignina, puesto que una vez depolimerizada, bacterias y otros hongos pueden continuar la tarea.

Cuando aún no se conocía la existencia de la ligninasa y se sostenía que los radicales libres jugaban un rol crucial en el mecanismo de degradación, en cierto sentido no se estaba tan lejos de la realidad. En efecto, la ligninasa es una hemoproteína que contiene un átomo de hierro en su sitio activo. Este es oxidado, en una primera etapa, por el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada), el cual es producido también en fase estacionaria por estos hongos. Para volver a su estado basal la ligninasa le "roba" un electrón a la lignina, creando radicales catiónicos sobre ésta. Estos son tremendamente reactivos y oxidantes y van a producir el corte de los enlaces más importantes entre las unidades de lignina y, a su vez, crearán nuevos radicales. De esta forma, estos últimos se propagan a través de la molécula y provocan su depolimerización.

Con respecto al pH óptimo de acción de la enzima, es curioso constatar que fluctúa entre 2,5 y 3,0. En cambio el pH óptimo de la actividad del hongo es de 4,5.

Las cantidades secretadas de enzimas en el medio de cultivo son extremadamente bajas, lo que impide hasta el momento su producción en planta piloto o a mediana escala y, en consecuencia, su utilización a nivel industrial. Además, existe una segunda limitante, si se toma la enzima purificada lo que se obtendrá paradojalmente es una polimerización de la lignina. La explicación de esta circunstancia reveladora se sustenta en la presencia de otras enzimas o factores que serían imprescindibles para su degradación.

Los avances de la investigación internacional en el campo de la celulosa y la lignina no sorprende con los brazos cruzados a Chile. Por lo menos cuatro planteles superiores están preocupados de entregar respuestas propias a estos problemas. Ellos son la Universidad de Chile, la Pontificia Universidad Católica de Chile, la Universidad de Concepción y la Universidad de La Frontera, en Temuco. Sin duda que es una noticia alentadora.



Eduardo Agosin

Laboratorio de Biotecnología, INTA.

Lilian Duery A.

Comunicaciones Científicas, Facultad de Ciencias.
Universidad de Chile.



Para saber más


1. Kirk, T.K., H.M. Chang. Enzyme and Microbiol. Technology
3, 189-196, 1981.

2. Kirk, T.K., Schultz, E. et al. Archives of Microbiology 117, 277-285, 1978.